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고농도 포도당에 의한 PKC-δ 의존성 NAD(P)H oxidase 활성화를 통한 혈관 평활근 세포 증식

High Glucose Modulates Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation Through Activation of PKC-δ-dependent NAD(P)H oxidase

당뇨병 2006년 30권 6호 p.416 ~ 427
KMID : 0354720060300060416
김보현 ( Kim Bo-Hyun ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실

이창원 ( Lee Chang-Won ) - 부산성모병원 내과
박정래 ( Park Jung-Lae ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실
강양호 ( Kang Yang-Ho ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실
김인주 ( Kim In-Ju ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실
김용기 ( Kim Yong-Gi ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실
손석만 ( Son Suk-Man ) - 부산대학교 의과대학 내과학교실

Abstract

연구배경:산화 스트레스가 당뇨병에서 혈관 내피세포의 기능장애와 혈관 평활근 세포의 증식, 혈소판 응집 증가 등에 관여하여 당뇨병성 혈관 합병증이 발생하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 고혈당이 당뇨병성 혈관 합병증의 발생에 미치는 영향에 대해서는 여러 가설들이 제시되고 있다. 고혈당에 의해 혈관 평활근 세포에서 ROS 생성이 의미있게 증가한다는 사실을 이전 연구에서 확인되었다. ROS 생성은 PKC-δ 활성화의 증가와 연관이 있다. 따라서 본 연구에서는 PKC-δ가 ROS 생성을 야기하고 고혈당 유발성 혈관 평활근 세포의 증식에서의 신호 전달체계에서의 역할을 알아보고자 하였다.

방법:쥐 대동맥 혈관 평활근 세포를 5.5 mmol/L 및 30 mmol/L D-glucose와 삼투성 대조군으로 48시간 동안 처리한 후 혈관 평활근 세포의 증식 (세포수 및 BrdUincorporation과 세포주기)과 superoxide생성 및 다양한 억제제의 영향, PKC-δ와 p38 MAP kinase의 활성화 정도를 측정하였다.

결과:1) 30 mmol/L D-glucose 배양 조건에서 혈관 평활근 세포의 수와 BrdU incorporation이 의미있게 증가하였고
NAD(P)H oxidase억제제인 DPI로 전처리 한 경우 증가 되었던 혈관 평활근 세포의 증식이 의미있게 감소하였다. 2) 혈관 평활근 세포 내 superoxide 음이온의 생성량은 30 mmol/L D-glucose 배양 조건에서 의미있게 증가하였으며 DPI, SOD로 전처리 한 경우 의미있게 감소하였다. 3) 혈관 평활근 세포에서 p38 MAP kinase 활성화에 대한 고농도 포도당의 영향은 대조군과 비교하여 의미있게 활성도가 증가하였고 rottlerin과 PKC-δ siRNA로 전처리 하였을 때 증가된 p38 MAP kinase 활성이 의미있게 감소하
였다.4) 고혈당으로 처리된 혈관 평활근 세포에서 PKC-δ siRNA의 transfection은 증가된 superoxide 음이온 생성을의미있게 감소시켰고 rottlerin과 PKC-δ siRNA로 전처리하였을 때 고혈당에 의해 증가된 세포 증식을 의미있게 감소시켰다.

결론: 이상의 결과를 종합하면 고농도 포도당 조건에서혈관 평활근 세포의 증식은 고농도 포도당에 의해 PKC-δ를 매개로 하는 NAD(P)H oxidase가 활성화되어 superoxide 음이온의 생성이 증가하였기 때문인 것으로 생각된다.

Background:Oxidative stress is thought to be one of the causative factors contributing to macrovascular omplications in diabetes. However, the mechanisms of development and progression of diabetic vascular complications are poorly understood. We hypothesized that PKC-δ isozyme contributes to ROS generation and determined their roles in the critical intermediary signaling events in high glucose-induced proliferation of vascular smooth muscle (VSM) cells.

Methods:We treated primary cultured rat aortic smooth muscle cells for 72 hours with medium containing 5.5 mmol/L D-glucose (normal glucose), 30 mmol/L D-glucose (high glucose) or 5.5 mmol/L D-glucose plus 24.5 mmol/L mannitol (osmotic control). We then measured cell number, BrdU incorporation, cell cycle and superoxide production in VSM cells. Immunoblotting of PKC isozymes using phoshospecific antibodies was performed, and PKC activity was also measured.

Results:High glucose increased VSM cell number and BrdU incorporation and displayed significantly greater percentages of S and G2/M phases than compared to 5.5 mmol/L glucose and osmotic control. The nitroblue tetrazolium (NBT) staining in high glucose-treated VSM cell was more prominent compared with normal glucose-treated VSM cell, which was significantly inhibited by DPI (10 μM), but not by inhibitors for other oxidases. High glucose also markedly increased activity of PKC-δ isozyme. When VSM cells were treated with rottlerin, a specific inhibitor of PKC-δ or transfected with PKC-δ siRNA, NBT staining and NAD(P)H oxidase activity were significantly attenuated in the high glucose-treated VSM cells.Furthermore, inhibition of PKC-δ markedly decreased VSM cell number by high glucose.

Conclusion:These results suggest that high glucose-induced VSM cell proliferation is dependent upon activation of PKC-δ, which may responsible for elevated intracellular ROS production in VSM cells, and this is mediated by NAD(P)H xidase.
KeyWords

Diabetic vascular complication, High glucose, NAD(P)H oxidase, PKC-δ, Vascular smooth muscle cell
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