잠시만 기다려 주세요. 로딩중입니다.

As2O3에 의한 NB4 백혈병 세포주에서 아포프토시스의 유도

Arsenic Trioxide (As2O3) Induced Apoptosis in NB4 Cell lines

대한혈액학회지 2002년 37권 3호 p.200 ~ 211
박경배 ( Park Kyeong-Bae ) - 순천향대학교 의과대학 소아과학교실

홍대식 ( Hong Dae-Sik ) - 순천향대학교 의과대학 내과학교실
서원석 ( Suh Won-Suk ) - 순천향대학교 의과대학 소아과학교실
이남수 ( Lee Nam-Su ) - 순천향대학교 의과대학 내과학교실
박성규 ( Park Sung-Kyu ) - 순천향대학교 의과대학 내과학교실
원종호 ( Won Jong-Ho ) - 순천향대학교 의과대학 내과학교실
정희정 ( Jung Hee-Jung ) - 순천향대학교 의과대학 임상분자생물학연구소
김숙자 ( Kim Sook-Ja ) - 순천향대학교 의과대학 임상분자생물학연구소
홍영선 ( Hong Young-Seon ) - 가톨릭대학교 의과대학 내과학교실
진종률 ( Jin Jong-Youl ) - 가톨릭대학교 의과대학 내과학교실
박희숙 ( Park Hee-Sook ) - 순천향대학교 의과대학 내과학교실
신상만 ( Shin Sang-Mann ) - 순천향대학교 의과대학 소아과학교실

Abstract

배경: 최근에 재발된 불응성 급성전골수구성백혈병 환자의 다수가 arsenic trioxide As2O3) 로 관해에 유도되었다는 보고가 있었다. 급성전골수구성백혈병의 치료에서 As2O3의 세포학 및 분자학적 기전을 설명하기 위해 전골수구성백혈병 세포주를 갖고 많은 시험관내 실험을 하였다.
이전 연구 결과 As2O3는 급성전골수구성백혈병 세포주의 증식을 억제하고 아포프토시스를 유도하였다. 본 연구는 급성전골구수성백혈병에서 유래된 NB4 세포주에서 As2O3에 의해 유도된 아포프토시스의 시험관내 기전을 밝히고자 시행되었다.


방법: As2O3의 다양한 농도에서 효과를 보기 위해, 0.1, 0.5, 1 및 2μM/L를 첨가하고 NB4 세포를 배양하였다. 아포프토시스를 분석하기 위해 DNA 분절검사와 TUNEL법을 시행하였다. 아포프토시스된 NB4 세포주에서의 분자학적 변화를 보기 위해 PML-RARα 유전자 표현은 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)과 Westernblot 분석으로 보았고, bcl-2 및 box 유전자 측정을 위해 흐름세포측정기를 이용했다. Caspase 활성을 알아보기 위해 procaspase 표현을 Western blot 분석과 유세포측정기로서 확인하였다.


결과: 배양 2일동안 상대적으로 높은 농도인 0.5에서 2μM/L에서 NB4 세포주의 아포프토시스가 유도되었다. 2일간 배양후 PMR-RARα 유전자표현은 Western blot 분석과 RT-PCR 로 분석한 결과 현저히 감소하였다. Bcl-2 표현도 유세포측정기상 감소하였다. 유세포측정기로 분석한 bax의 표현도 고농도 (2μM/L) 에서 뚜렷한 증가를 보였으나 저농도 (0.5μM/L)에서는 변화가 없었다. Capase -3의 proenzyme이 Western blot 분석상 저농도(0.5μM/L) 에서보다 고농도(2μM/L) 에서 현저히 떨어졌으며 procaspase 7도 고농도(2μM/L) 에서 감소되었다.


결론: NB4 백혈병 세포주는 As2O3에 의해 아포프토시스가 유도되며, 고농도에서 급격히 진행되고, 아포프토시스 과정에서 caspase 3 및 7의 활성화, PML-RARα 유전자의 소실, bcl-2 의 하양조절과 bax의 상향조절 등이 확인되었다. 따라서 As2O3는 급성전골수구성백혈병 세포에서 아포프토시스를 유발하고 세포 분화를 유도하므로 이를 응용하여 효과적인 치료제로 사용될 수 있으며, 기존의 치료에 저항성이 있거나 재발된 환자에서 적은 부작용으로 안전하게 사용될 수 있으며, 또한 As2O3를 이용한 아포프토시스 기전의 연구는 급성전골수구성백혈병 외에 다른 악성 종양질환의 세포형태학적 및 분자생물학적 연구와 임상적 응용에도 도움을 줄것으로 생각된다.

Background: Recently, inorganic arsenic trioxide (As2O3) was reported to induce complete remission in high proportion of patients with refractory promyelocytic leukemia (APL). To illustrate cellular and molecular me chanisms of As2O3 in the treatment of APL, many experimental studies were performed on APL-derved cell lines in vitro. Previous studies showed that As2O3 inhibited proliferation and induced apoptosis in the APL-derved cell lines. This study was done to clarify the invitro mechanisms of As2O3-induced apoptosis in APL-derived NB4 cell lines.


Method: To determine the effects of As2O3 in the various concentrations, NB4 cells were cultured with 0.1 to 2μM/L of As2O3. To assay the apoptosis in NB4 cell lines, DNA fragmentation assay and TUNEL were performed. To find out the molecular change of As2O3-induced apoptotic NB4 cell lines, RT-PCR and Western blot analysis for PML-RARα chimeric protein expression and flow cytometry for bcl-2/bax expression were performed. To clarify the caspase activation pathway, Western blot analysis and flow cytometry for procaspase expression were performed.


Results: As2O3 induces apoptosis on NB4 cells in relatively high concentration (0.5 to 2μM/L) for 2 days. After 2 days of culture the PML-RARα chimeric protein expression decreased rapidly by Western blot and RT-PCR analysis and bcl-2 expression also decreased by flow cytometry. The expression of bax by flow cytometry showed a marked increase in high concentration (2μM/L) but there was no change in low concentration (0.5μM/L). In the Western blot analysis, the amount of proenzyme of caspase-3 was significantly decreased in the cells with high concentration (2μM/L) compared with that in the cells with low concentration (0.5μM/L). As2O3 induces proteolytic processing of pro-caspase 7 but not pro-caspase 9 and 8.


Conclusion: Apoptosis of APL-derved NB4 cell lines was induced by As2O3 and progressed rapidly in higher concentrations. During aoptosis, activation of caspase-7 pathway and degradation of PML-RARα chimeric protein, decrease in bcl-2 and increase in bax were shown.

키워드

Arsenic trioxide (As2O3) Apoptosis; NB4 Cell lines; Caspase
원문 및 링크아웃 정보
  
등재저널 정보
KCI
KoreaMed
KAMS