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분자 샤페론을 사용한 연속확산식 무세포단백질 발현 시스템에서의 재조합 Plasminogen Activator의 효율적 발현

Enhanced Synthesis of Active rPA in the Continuous Exchange Cell-free Protein Synthesis (CECF) System utilizing Molecular Chaperones

한국생물공학회지 2006년 21권 2호 p.118 ~ 122
박창길 ( Park Chang-Gil ) - 충남대학교 공과대학 정밀공업화학과

김태완 ( Kim Tae-Wan ) - 서울대학교 공과대학 화학생물공학부
최차용 ( Choi Cha-Yong ) - 서울대학교 공과대학 화학생물공학부
김동명 ( Kim Dong-Myung ) - 충남대학교 공과대학 정밀공업화학과

Abstract

본 연구에서는 연속확산식 무세포 단백질 발현 시스템을 이용한 이황화결합 함유 단백질의 생산 시, 발현된 단백질의 응집으로 인한 비활성화의 문제점이 분자샤페론을 통한 발현 단백질의 용해도 증가, 세포 파쇄액의 화학적 처리를 통한 환원활성 제거, 산화환원완충액을 이용한 적절한 산화환원전위의 제공 등을 통해 단백질의 폴딩에 유리한 반응조건을 구축함으로써 해결될 수 있음을 보였다. 이러한 연구 결과는 각종 게놈 시퀀싱 프로젝트의 빠른 진척에 따라 현재 요구되고 있는 고속, 고효율의 단백질 발현 수단으로써 무세포 단백질 발현 시스템이 적용될 수 있는 가능성을 높여 줄 수 있을 것으로 기대된다.

In this report, we describe that the use of GroEL/GroES-enriched S30 extract remarkably enhances the solubility and enzymatic activity of cell-free synthesized rPA, which requires the correct formation of 9 disulfide bonds for its biological activity. We found that the stable maintenance of redox potential is necessary, but not sufficient for the optimal expression of active rPA. In a control reaction without using additional molecular chaperones, most of the rPA molecules were aggregated almost instantly after their expression and thus failed to exhibit the enzymatic activity. However, by the use of GroEL/GroES-enriched extract, combined with IAM-treatment, approximately 30 ㎍/㎖ of active rPA was expressed in the cell-free synthesis reaction. This result not only demonstrates the efficient production of complex proteins, but also shows the control and flexibility offered by the cell-free protein synthesis system.

키워드

rPA;CECF;continuous exchange cell-free protein synthesis;molecular chaperone;IAM
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