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자궁경부암 세포주들에서 Adenosin Triphosphate(ATP)에 의한 세포내 칼슘이동과 세포 증식의 영향에 관한 연구

ATP-induced Calcium Mobilization and Proliferation in Cervical Cancer Cells

대한산부인과학회지 1999년 42권 6호 p.1332 ~ 1338
허윤 (  ) - 가톨릭대학교

김근수 (  ) - 가톨릭대학교 의과대학 약리학교실

Abstract

목적 : ATP같은 nucleotide들은 세포 표면의 purinergic receptor에 작용하여 여러 가지
생리적 반응들을 일으킨다. 자궁경부암 세포들에서 nucleotide들의 역할을 알아내기 위하여
네 종류의 자궁경부암 세포주들(Caski, HelaS3, ME180 및 SiHa)에서 세포내 칼슘농도의 이
동과 세포 증식에 대한 ATP의 효과를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
방법 : ATP는 Boehringer (Mannheim, Germany); U73122는 Research Biochemicals Inc.
(Natic, USA); adenosine ionomycin, Fua-2와 Fura2/AM은 Sigma Chemiacal Co. (St.
Louis, USA); Dulbecco's modified Eagle medium (DMED), penicillin-streptomycin 및
fetal bovine serum은 GIBCO (Grand Island, NY); suramin은 Wako (Tokyo, Japan)의 것
을 사용하였다. 세포는 실험 5일에 trypsin 처리하여 얻고 105cell/dish의 농도로 35㎜
plastic culture dish의 바닥에 구멍을 내어 부착시킨 22×22㎜ 커버글라스에 배양하였다. 세
포는 modified Hanks' solution(단위 mM: NaCl, 127; 0.33 of each MgSO4 and Na2HPO4;
KH2P04, 0.44; MgC12, 1; HEPES, 10; CaC12, 1 (pH 7.4))으로 세척 한 후 Fura2/AM
(10uM)으로 45분간 37℃에서 loading하였다. Fluorescence는 Intracelluar Imaging Inc.
(Cincinnati, OH, USA)에서 제작한 InCaTM Imaging System을 이용하였다. Calcium-free
실험은 500uM EGTA를 calcium-free bathing solution에 첨가하였다.
모든 값은 평균±표준오차로 나타내었으며 Student' t-test로서 그룹간 차이의 유의성을
결정하였다. 0.05보다 작은 P 값은 통계적으로 의미가 있는 것으로 하였다.
결과 : 네 종류의 세포주에서 ATP (10-7M-10-3M)는 용량에 비례하여 세포내 칼슘 농도
를 증가시켰다. 세포외액 제거와 PLC억제제인 U73122 처치는 ATP에 의한 세포내 칼슘 증
가를 현저히 억제시켰다. 네 종류의 세포들 중에서 SiHa의 성장속도가 가장 높았으며
Caski, ME180그리고 HeLaS3의 순서였다. ATP에 의한 세포 증식효과는 ATP처치 후 4일
과 5일에 관찰되었다.
결론 : 이러한 결과는 ATP가 purinoceptor에 의한 세포내 칼슘이동을 거쳐 자궁경부암세
포의 증식을 유도하는 것으로 사료된다.

Purpose : Nucleotides such as ATP can act as extracellular effector molecules by
interaction with specific cellular receptors. To know the role of nucleotides in cervical
cancer cells, we observed the effect of ATP on cytosolic free calcium ([Ca2+])
mobilization and cell proliferation in four human cervical cancer cell lines, Caski,
HeLaS3, ME180 and SiHa cells.
Material and method : The materials used were purchased from the following souses:
ATP from Boehringer (Mannheim, Germany); U73122 from Research Biochemicals Inc,
(Natic, USA); adenosine, ionomycin, Fura-2 and Fura-2/AM from Sigma Chemical (St.
Louis, USA); Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), penicillin-streptomycin and
fetal bovine serum from GIBCO (Grand Island, NY); suramin from Wako (Tokyo,
Japan). All the other chemicals of the highest grade are available for the experiment.
Cells were harvested after trypsinization at five days before the experiments, and seeded
onto 22×22㎜ cover glasses at the concentration of 105cells/dish. The cover glass was
attached to a 1㎝ hole located at the bottom of 35㎜ plastic culture dishes. Cells were
then washed with modified Hanks' solution consisting of the following elements (in
mM): NaCl, 127; 0.33 of each MgSO4 and Na2HPO4; NH2PO4, 0.44; MgC12, 1; HEPES,
10; CaC12, 1 (pH 7.4): and loaded Fura-2/AM (10 μM) for 45 min at 37℃.
Fluorescence-loaded cells were washed three times with the same solution for exclusion
of unloaded Fura-2/AM. The fluorescence of C6 glioma cells were measured at room
temperature using the InCaTM Imaging System manufactured by Intracellular Imaging
Inc. (Cincinnati, OH, USA). For the calcium-free experiment, 10 μM (final
concentration) of EGTA solution was added to the calcium-free bathing solution. The
concentration of [Ca2+]i was calculated from the standard curve generated in situ.
Results : In these cells, extracellular AIP (10-7M-10-359 elevated [Ca2+]i in a
dose-dependent manner. In all four cell lines, ATP-induced [Ca2+]i increases were
attenuated in the extracellular calcium-free conditions. The pretreatment of U73122,
phospholipase C (PLC) inhibitor, suppressed ATP-induced [Ca2+]i increment clearly.
Among the four cell lines, SiHa showed the highest proliferation activity followed by
Caski, ME180 and HelaS3. The significant increases in cell proliferation were observed
at 4 and 5 days after ATP treatment in all ceil lines.
Conclusion : These data suggest that ATP, possibly released at sites of tissue injury
or inflammation, might induce the proliferation of cancer cell via purinoceptor-mediated
intracellular free calcium mobilization.

키워드

ATP; 자궁경부암; calcium; ATP; cervical cancer; calcium;
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