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생쥐 pre-antral follicle의 체외 배양체계의 확립: 호르몬 무첨가 배양액에서 협막-기질세포에 의한 난포의 체외성장 효과

Establishment of Culture System for In Vitro Culture of Mouse Pre-antral Follicles: Effect on In Vitro Growth by Thecal-Stromal Cells in Culture Medium without Hormones

대한산부인과학회지 2004년 47권 3호 p.507 ~ 514
이기환/Lee KH
김주환/서영석/송해범/강길전/Kim JH/Seo YS/Song HB/Kang KC

Abstract

목적: 본 연구는 난포를 체외에서 배양함에 있어 난포막 주위에 부착되어 있는 협막세포와 기질세포에 의한 pre-antral 난포의 체외성장에 대한 효과를 검토하기 위해 수행되었다.

연구 방법: 본 연구에서 사용된 pre-antral 난포 (100-130 µm)는 30 gauge 주사바늘을 이용하여 기계적인 분리방법에 의해 20-25일령 암컷 생쥐의 난소로부터 분리되었다. 분리된 난포는 난포막의 주위에 있는 thecalstromal 세포의 부착정도에 따라 세 그룹으로 분류하였으며, 실험군 Ⅰ의 최초크기는 112.5 (mean)±6.2 (SD)µm (n=31)였고, 실험군 Ⅱ는 112.8±7.8 µm (n=23), 실험군 Ⅲ은 115.1±6.5 µm (n=27)였다. 분류된 pre-antral 난포들은 신선한 Ham’s F-10에서 세척한 후 DMEM 배양액의 20 µl 소적을 만들고 그 위에 mineral oil을 덮은 60 mm 배양접시에서 한 개의 소적에 한 개의 난포를 배양하였다. 모든 실험군의 배양액은 매 2일마다 신선 배양액으로 전부 교체해 주었고, 6일 동안 배양하였다. 배양된 난포와 난포 내 난자의 크기는 접안렌즈의 ‘+’ 자형 micrometer를 이용하여 200배율에서 측정하였다. 결과에 대한 통계적인 검증은 Student’s t-test를 이용하여 p 값이 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과: 본 연구에 사용된 모든 난포들의 최초 평균지름과 표준편차는 113.3±2.2 µm였다. 난포의 성장률은 실험군 Ⅲ이 배양 전 기간 동안 실험군 Ⅰ, Ⅱ보다 현저하게 (p<0.05) 높았다. 실험군 Ⅰ과 Ⅱ는 배양 1일에서 3일까지는 성장률에서 차이를 보이지 않았지만, 배양 4일째부터는 유의한 차이를 보였다. 실험군 Ⅰ과 Ⅱ 그리고 Ⅲ에서 6일 동안 성장한 난포의 크기는 각각 155.2±18.7 µm, 196.9±24.1 µm 그리고 284.2±47.6 µm로 실험군 Ⅲ은 배양 시작일로부터 무려 147%나 성장하였다. 세 그룹 사이의 난포 내 난자의 성장률은 배양기간에 따른 차이가 없었으며, 지속적으로 성장하는 양상이 나타났다. 배양 7일째부터의 난포크기는 난포 구조의 붕괴와 과립막세포의 outgrowth 때문에 측정되지 못했다.

결론: 본 연구에서 사용된 난포들은 호르몬이 첨가되지 않은 DMEM 배양액에서 잘 성장하였고, 난포막의 표면에 부착되어 있는 thecal-stromal 세포는 난포의 체외성장에 효과적으로 작용하였다.

Objective: This present study was conducted to examine the effects on in vitro growth of pre-antral mouse follicles by thecal-stromal cells attached to around the follicular membrane in culture medium without hormones.

Methods: Pre-antral follicles (100-130 micro meter) used in our studies were isolated mechanically by fine 30 G needles attached to 1 ml insulin syringe from mice ovaries of 20-25 days old female ICR strain. Isolated pre-antral follicles were divided into three groups by attached status of thecal-stromal cell layers to follicular membrane. Follicular Initial diameters of group I was 112.5 (mean) +/- 6.2 (SD) micro meter (n=31), group II was 112.8 +/- 7.8 micro meter (n=23), and group III was 115.1 +/- 6.5 micro meter (n=27). Divided pre-antral follicles were washed in fresh Ham’s F-10 medium and cultured in 20 micro liter droplets of DMEM with glutamine, glucose and pyruvate under mineral oil on the 60 mm culture dish. All experimental media were supplemented with 10% FBS without hormones. Media were exchanged wholly by fresh media every 2 days in culture. Diameters of intrafollicular oocytes and cultured pre-antral follicles were measured using an precalibrated cross ocular micrometer at X200 every day during 6 days in vitro culture. Results were considered statistically significant when p value was less than 0.05 using Student’s t-test.

Results: The mean and standard deviation (SD) of initial diameters of pre-antral follicles was 113.5 +/- 2.2 micro meter in three groups. Follicular growth rate of group III was significantly (p<0.05) higher in whole culture periods than group I and group II. Rate of follicular growth between group I and group II were not significant difference in culture for 1 to 3 days. However, group II was significantly higher than group I in culture for 4 days. Diameters of grown follicles for 6 days was 155.2 +/- 18.7 micro meter, 196.9 +/- 24.1 micro meter and 284.2 +/- 47.6 micro meter in group I, group II and group III, respectively. Growth rate of intrafollicular oocytes between three groups were not difference and revealed to continuous growth patterns in whole culture periods. Follicular diameter after culture for 7 days were not measured because of disruption of follicular structure or outgrowth of granulosa cells.

Conclusion: Pre-antral follicles were grown very well in DMEM medium without hormones. Thecal- stromal cells attached to the surface of follicular membrane has acted effectively in vitro growth of follicles.

키워드

Mouse pre-antral follicles;Intralfollicular oocytes;In vitro growth;Follicular diameters;생쥐 난포강 전 난포;난포 내 난자;체외성장;난포의 지름
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