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부인암 세포주에서 항암제 투여에 따른 신생혈관 형성 관련 유전자 전령 리보핵산 및 단백질 표현 양상에 관한 연구

Expression analysis of mRNA and proteins related to angiogenesis following management with cytotoxic agents in gynecologic cancer cell Lines

대한산부인과학회지 2007년 50권 3호 p.476 ~ 485
김영재 ( Kim Young-Jae ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실

공미숙 ( Kong Mi-Sook ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실
이영미 ( Lee Young-Mee ) - 한양대학교 의과대학 임상교수 연구실
장성렬 ( Chang Sung-Yeoul ) - 한양대학교 의과대학 임상교수 연구실
김승룡 ( Kim Seung-Ryong ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실
김경태 ( Kim Kyung-Tai ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실
황윤영 ( Hwang Youn-Yeung ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실
조삼현 ( Cho Sam-Hyun ) - 한양대학교 의과대학 산부인과학교실

Abstract

목적: 본 연구자는 확립된 세포주에서 세포독성제 및 면역 조정제에 의한 항신혈관 형성효과를 확인하고자 하였다. 유방암 세포주 MCF-7, 자궁 경부 편평 상피암 세포주 SiHa, 난소암 세포주 A2780, 그리고 cisplatin 내성 난소암 세포주 A2780-CDDP에서 cisplatin, paclitaxe l(taxol), 및 thalidomide로 처리한 후에 vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), 그리고 thrombospondin-1,2 (TSP-1,2)의 전령 리보 핵산 및 단백질의 표현 양상의 변화를 규명하고자하였다.

대상 및 방법: 유방암 세포주 MCF-7, 자궁 경부 편평 상피암 세포주 SiHa, 난소암 세포주 A2780, 그리고 cisplatin 내성 난소암 세포주 A2780-CDDP에서 cisplatin, paclitaxel (taxol), 및 thalidomide로 각각 처리한 후에 vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), 그리고 thrombospondin-1,2 (TSP-1,2)의 전령 리보 핵산 및 단백질의 표현 양상의 변화를 규명하고자 RT-PCR, 단백 추출 및 Western blot assay를 사용하였다.

결과: 난소암 세포주 A2780과 동일 세포주에서 분리한 cisplatin 내성 주 A2780-CDDP, 유방암 세포주 MCF-7 및 자궁경부 편평 상피암 세포주인 SiHa에서 VEGF gene은 212 bp, bFGF는 238 bp, 그리고 TSP-1은 492 bp로 합성되었으나 TSP-2 는 합성되지 않았으며 VEGF 및 bFGF 단백질은 각각 21 KDa와 17 KDa로 합성되었으나 TSP-1 단백질은 합성되지 않았 다. 각 세포주의 VEGF gene의 발현 정도는 cisplatin, taxol 및 thalidomide에 별 큰 영향을 받지 않았다. bFGF gene의 발현 정도는 taxol처리 후 유방암 세포주에서 만 감소하였으며 TSP-1 gene의 발현도는 taxol 처리 후 유방암 세포주에서 자궁 경부암 세포주 보다 큰 폭의 감소가 있었고 난소암 세포주에서 thalidomide처리 후 뚜렷한 감소를 보였다. Cisplatin, taxol, 그리고 thalidomide에 VEGF 및 bFGF 단백질 발현도는 아무런 영향을 받지 않았다.

결론: 난소암 세포주 A2780, cisplatin 내성 난소암 세포주 A2780-CDDP, 유방암 세포주 MCF-7, 그리고 자궁경부 편평 상피 암 세포주 SiHa에서 VEGF, bFGF 그리고 TSP-1 gene들 및 단백질의 발현 양상은 cisplatin 처리에 의해 변화되지는 않는 것으로 확인되어 난소암, 유방암 그리고 자궁경부암에서 cisplatin의 신혈관 형성 억제 효과 판정에는 VEGF, bFGF 및 TSP-1 등의 직접적인 단백 발현 양상만을 표적으로 삼기 보다는 기저층 파괴를 담당하는 신호 전달체등의 발현 변화를 동시에 분석하여야 할 것으로 사료되며, 통계적으로 유의하지는 않았지만 taxol 처리에 따른 신혈관 형성 단백 유전자들 의 발현 양상에 있어 bFGF가 유방암 세포주에서 약간 감소되었고, TSP-1은 유방암 세포주에서 자궁경부암 세포주보다 약간 더 많은 감소를 보여 bFGF와 TSP-1은 유방암 및 자궁경부암에서 taxol의 신혈관 형성 저해 연구의 평가 기준으로 재연구될 필요가 있을 것으로 생각된다. 역시 통계적으로 유의한 정도는 아니었으나 Thalidomide 처리에 따른 전기 단백 질들의 표현 양상에는 난소암 세포주 A2780에서 TSP-1 단백 발현의 감소가 다른 세포주보다 많은 것으로 나타나, 실험 방법에 따라 같은 세포 독성제라도 신혈관 형성 저해 효과 판정이 다르다는 것을 확인시켜 줌과 동시에 향후 thalidomide 를 난소암의 보조적 치료제로 이용하는 연구의 필요성을 제시하였다.

Objective: Angiogenesis is central role to both the proliferation and metastasis of malignant tumor. The intense interest in angiogenesis has also lead to a re-examination of the activity of established cytotoxic agents which are known to be an antiangiogenic effect anecdotally. In this study, anti-angiogenic effect of cisplatin, paclitaxel and thalidomide was evaluated in human ovarian cancer cell lines and cervical cancer cell line.

Methods: Human ovarian cancer cell line A2780, cisplatin resistant human ovarian cancer cell line A2780-CDDP, human breast cancer cell line MCF-7, and squamous cell uterine cervical carcinoma cell line SiHa were used to evaluate the level of mRNA and protein expression of VEGF, bFGF and TSP-1, 2 before and after the treatment with cisplatin, paclitaxel, and thalidomide using RT-PCR, protein extraction, and Western blot. The results were analyzed with Wilcoxon signed rank test in the SAS ver 8.1.

Results: Targeted mRNAs were synthesized as 212 bp VEGF, 238 bp bFGF, and 492 bp band sized except mRNA of TSP-2 via RT-PCR. The protein of VEGF and bFGF were appeared as 21KDa and 17 KDa size, however, the protein of TSP-1 was not appeared through western blot. No effect of cisplatin on protein expression was measured in these cell lines, but paclitaxel influenced the expression of bFGF in MCF-7 cell line and the expression of TSP-1 in MCF-7 and SiHa cell lines. TSP-1 expression was influenced by thalidomide in A2780 cell line. The protein expression of VEGF and bFGF were not influenced following treatment with cisplatin, paclitaxel, and thalidomide.

Conclusion: These results were suggested that bFGF and TSP-1 will be used as a target gene for the assay of antiangiogenic effect of paclitaxel in breast and uterine cervical cancer tissue and TSP-1 will be used as that of thalidomide in ovarian cancer. Furthermore, thalidomide will be tried as an adjunctive agent for the improvement of the survival in the case of the patient with ovarian cancer.

키워드

부인암;신혈관형성;시스플라틴;탁솔;탈리도마이드
Gynecologic cancer;Angiogenesis;Cisplatin;Paclitaxel;Thalidomide
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