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글루코스와 피부르산염의 농도가 조절된 DMEM과 Vero 세포를 이용한 무혈청 적응용 배양액의 개발에 관한 연구

Studies on development of serum-free conditioned media using Vero cells and DMEM with controlled concentration of glucose and pyruvate

대한산부인과학회지 2010년 53권 2호 p.143 ~ 151
김주환 ( Kim Ju-Hwan ) - 미즈여성병원 생식의학연구소

서영석 ( Seo Young-Seok ) - 미즈여성병원 생식의학연구소
송해범 ( Song Hai-Bum ) - 대구대학교 생명환경대학 동물자원학과
양정보 ( Yang Jung-Bo ) - 충남대학교 의학전문대학원 산부인과학교실
이경은 ( Lee Kyung-En ) - 충남대학교 의학전문대학원 산부인과학교실
이기환 ( Lee Ki-Hwan ) - 충남대학교 의학전문대학원 산부인과학교실

Abstract

목적: 본 연구는 글루코스와 피부르산염이 조절된 DMEM을 이용해 Vero 세포를 배양한 후 무혈청 적응용 배양액 (Serum-free Vero cell conditioned medium, SF-VCM)을 얻어 생쥐의 착상 전 생쥐 배아의 체외발달에 미치는 효과를 보기 위해 수행되었다.

연구 방법: 총 846개의 2-세포기 배아를 4~5주령의 ICR 계통 생쥐로부터 얻었다. 글루타민만 함유되어 있는 DMEM (DMEM-G)과 글루타민, 글루코스 및 피부르산염을 함유하고 있는 DMEM (DMEM-GGP)을 각각 3:1 (#1), 1:1 (#2) 및 1:3 (#3)의 비율로 혼합한 배양액을 제조하였다. Vero 세포 단층이 형성된 배양용기에 DMEM #1 배양액을 각각 10 mL, 30 mL 및 50 mL 씩 넣어 48시간 배양 후 회수하여 보관하였다가 사용하였으며, 각각의 배양액에 생쥐배아를 배양하여 48시간 및 96시간에 발달을 비교하였다. 또한 20% 난포액을 함유하고 있는 DMEM #2 배양액을 Vero 세포와 공배양한 군을 대조군으로 하여 각각 DMEM #1, #2 및 #3 배양액으로 제조된 3가지 SF-VCM에도 생쥐배아를 배양하여 발달을 서로 비교하였다. Vero 세포와의 공배양군을 제외하고 모든 실험군에는 10% SSS를 첨가하여 사용하였다. 결과에 대한 유의성 검증은 Chi-square test를 이용하였고, P값이 0.05 이하일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

결과: DMEM #1 배양액 30 mL를 넣은 군에서 각 단계 발달률 (상실배아≤: 97.2%, 주머니배≤: 97.2%, 탈출 주머니배≤: 82.2%)이 다른 실험군들에 비해 유의하게 높게 나타났다 (P<0.05). Vero 세포와의 공배양과 다양한 SF-VCM에서 생쥐 배아의 체외배양 효과를 비교한 결과에서는 DMEM #1 배양액으로 제조된 SF-VCM #1 실험군 (Group I)에서 각 단계별 발달률 (상실배아≤: 98.1%, 주머니배≤: 97.1%, 탈출 주머니배≤: 81.7%)이 다른 실험군들에 비해 높게 나타났으며, 배양 96시간 후 탈출 주머니배 이상으로의 발달에서는 대조군 (67.6%)보다 유의하게 높은 발달률을 나타내었다 (P<0.05).

결론: Vero 세포 단층이 형성된 배양용기에 DMEM #1 배양액을 사용하여 SF-VCM을 제조하는 경우 250 mL 플라스크에 30 mL의 용량으로 배양하는 것이 가장 효과적이며, 이는 다른 농도의 배양액에 비해 더 높은 체외 발달률을 유도 할 수 있어 사람의 시험관 아기 시술에서 응용해 볼 만한 가치가 있을 것이라 사료된다.

Objective: The purpose of this study was to examine in vitro development of early preimplantation mouse embryos in various kind of serum-free conditioned media (SF-VCM) manufactured from DMEM cultured with Vero Cells.

Methods: A total of 846 two-cell mouse embryos were cultured in different kind of SF-VCM. SF-VCMs were divided into SF-VCM-10, -30 and -50 by media volume using DMEM #1 media, and divided into SF-VCM #1, #2 and #3 by controlled concentration of glucose and pyruvate (manufactured by DMEM #1: mixed three volume of DMEM-G (DMEM with glutamine without glucose and pyruvate) and one volume of DMEM-GGP (DMEM with glutamine, glucose, pyruvate), #2: mixed same volume of DMEM-G and DMEM-GGP and #3: mixed one volume of DMEM-G and three volume of DMEM-GGP, respectively). Experimental groups were mainly added 10% SSS, and 20% hFF was added to only Control group co-cultured with Vero cells. Development of embryos was observed every 24 hours. Results between different groups were analyzed using Chi-square test, and considered statistically significant when P-value was less than 0.05.

Results: In vitro developmental rate by each cleavage stages of mouse embryos cultured in SF-VCMs with a various volumes were significantly (P<0.05) higher in SF-VCM-30 (morula≤: 97.2%, Blastocyst (BL)≤: 97.2%, Hatching BL≤: 82.2%) than other groups. In the rate of development on in vitro co-culture vs. a various SF-VCMs manufactured by DMEM controlled concentration of glucose and pyruvate, Group I (SF-VCM #1) was higher than other groups in each cleavage stages (morula≤: 98.1%, Blastocyst (BL)≤: 97.1%, hatching BL≤: 81.7%, respectively). Moreover, specially, in the developmental rate into the hatching blastocyst ≤ after 96 hours in vitro culture, Group I (81.7%) was significantly higher than control group (67.6%, P<0.05).

Conclusion: SF-VCM #1 manufactured by volume of 30 mL DMEM #1 media cultured in vitro for 48 hours in 250 mL flask was the most effective on in vitro developmental rate of mouse preimplantation embryos. Therefore, it is expected that SF-VCM #1 has application to human IVF-ET.

키워드

무혈청 적응용 배양액;Vero 세포;DMEM;체외 공배양;체외수정
Serum-free conditioned media;Vero cells;DMEM;In vitro co-culture;In vitro fertilization
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