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Leucine zipper 또는 isoleucine zipper가 융합된 di/trimeric 바이오시밀러 휴미라 single-chain Fv 항체의 개발

The development of di/trimeric biosimilar Humira single-chain Fv antibody fused to leucine zipper or isoleucine zipper

미생물학회지 2020년 56권 3호 p.193 ~ 205
김진규, 김태환, 권승완,
소속 상세정보
김진규 ( Kim Jin-Kyoo ) - Changwon National University College of Natural Sciences Department of Bio-Health Science
김태환 ( Kim Tae-Hwan ) - Changwon National University College of Natural Sciences Department of Bio-Health Science
권승완 ( Kwon Seung-Wan ) - Changwon National University College of Natural Sciences Department of Bio-Health Science

Abstract

면역 반응에 필요하며 면역을 조절하는 사이토카인인 종양괴사인자-알파(TNF-α)는 종양괴사인자-알파 수용체와 상호작용이 필수적이다. 휴미라와 같은 바이오시밀러 중화항체를이용하여 종양괴사인자-알파(TNF-α)와 종양괴사인자-알파수용체(TNF-α receptor) 사이의 상호 작용을 억제하는 방법이자가 면역 질환 치료를 위하여 개발되었다. 우리는 단백질 데이터 은행과 homology modeling을 활용하는 생물정보학적연구를 통해 휴미라 항체의 종양괴사인자-알파와 결합하는성질을 분석하였다. 또한 우리는 단백질 데이터 은행에서 휴미라 중사슬 가변 부위(VH)와 경사슬 가변 부위(VL) 배열을알아내고 18개의 아미노산 링커로 연결시킨 Humira single chain variable domain 항체(ScFv: Humira)를 제조하였다. 1개의 항원 결합가로 인한 Humira의 낮은 항원 결합가는 항원 결합가를 높이기 위해 Humira의 multimerization을 필요로 한다. 그러므로 우리는 dimer를 형성시키는 leucine zipper (ScZip) 와 trimer를 형성시키는 isoleucine zipper (ILZ)를 연결시킴으로써 dimeric 또는 trimeric Humira ScFv를 구축하였다. Mono/ di/trimeric Humira들은 대장균에서 발현시키고 Ni+-NTA-아가로스 칼럼으로 정제하였다. 세 종류의 정제된 ScFv들은SDS-PAGE에서 각각 28.59 kDa, 33.70 kDa, 33.74 kDa으로탐지되었으나 size-exclusion chromatography에서는 leucine zipper는 비공유결합에 의한 dimer (ScZip)형성을, isoleucine zipper는 비공유결합에 의한 trimer (ILZ) 형성을 유도함을암시하는 28.59 kDa, 67.4 kDa, 101.22 kDa를 나타내었다. Dimeric 휴미라 ScFv (HumiraScZip)와 trimeric 휴미라 ScFv (HumiraILZ)의 종양괴사인자-알파 항원에 대한 결합력은ELISA 및 western blot에 의해 관찰되었다. Bio-layer interferometry 분석은 di/trimeric 휴미라 ScFv가 monomer보다 150~ 1,380배의 더 높은 결합력을 보여주었고 이는 leucine zipper 와 isoleucine zipper helix의 비공유결합인 소수성 결합에 의해 di/trimerization되어 직접적으로 항원 결합력 증가를 유도할 수 있음을 제시해주고 있다.

Tumor necrosis factor-alpha as an immunity-modulating cytokine required for immune processes requires interaction with TNF receptor. Blocking the interaction between TNF-α and TNF-α receptor by neutralizing biosimilar antibody such as Humira has been developed for the treatment of autoimmune diseases. We analyzed TNF-α binding properties of Humira antibody by bioinformatics studies using protein data bank and homology modeling. We also generated Humira single-chain variable domain antibody (ScFv: Humira) based on heavy chain variable region and light chain variable region sequences which were informed from protein data bank and joined with a single 18 amino acid linker. The low intrinsic affinity of Humira due to its monovalency requires multimerization of Humira to increase the antigen binding affinity. Thus, we constructed di/trimeric Humira by linking with the dimerizing leucine zipper and trimerizing isoleucine zipper domain. The mono/di/trimeric Humira were expressed in Escherichia coli and were purified by Ni+-NTA-agarose column. Three purified Humira ScFvs were detected as 28.59 kDa, 33.70 kDa, and 33.74 kDa in SDS-PAGE. However, size-exclusion chromatography showed 28.59 kDa, 67.4 kDa, and 101.22 kDa respectively suggesting that dimerization by leucine zipper and trimerization by isoleucine zipper induced Humira di/trimerization by non-covalent association. The TNF-α antigen binding activity of dimeric HumiraScZip and trimeric HumiraILZ were observed by ELISA and western blot. Bio-layer interferometry analysis showed that di/trimeric Humira ScFvs showed about 150~ 1,380 folds higher affinity than monomer suggesting that di/ trimerization by non-covalent hydrophobic association of leucine zipper and isoleucine zipper helix can directly leads to a boost of affinity.

키워드

dimerization; isoleucine zipper; leucine zipper;single-chain Fv; trimerization

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