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산화질소 공여물과 산화질소 합성효소 길항제가 백서 폐미세혈관 내피세포 산화제 손상에 미치는 영향

The Effect of Nitric Oxide Donor or Nitric Oxide Synthase Inhibitor on Oxidant Injury to Cultured Rat Lung Microvascular Endothelial Cells

결핵및호흡기질환 1998년 45권 6호 p.1265 ~ 1276
소속 상세정보
장준 김세규/김성규/이원영/JohnR.Michael/강경호/유세화/채양석/장준

Abstract

요약
연구배경 :
NO는 생체내에서 생성되는 유리 반응기로서 혈관 긴장도의 완화, 혈소판 응집 저지, 혈관
내피세포에 대한 백혈구 유착 방해, 감염에 대한 숙주 방어 등에서 중요한 역할을 한다. NO
는 전이 금속(transition metal), 산소, 기타 반응기 등과 쉽게 반응하므로 여러 생체내 반응
에 관여하여 산화제 손상을 촉진시키거나 감소시킬 가능성이 제기되었다. 급성 폐손상 및
급성 호흡곤란 증후군에서는 폐혈관 내피세포 및 호중구의 상호작용 및 산화제 손상이 매우
중요한 병인으로 알려져 있으며, NO를 급성 호흡곤란 증후군에서 흡입하여 치료하는 것은
산화제에 의한 혈관 내피세포 손상에서 외부로부터 NO를 공급하는 상황이다. 본 연구에서
는 외인성 NO의 공여나 내인성 NO 억제가 산화제에 의한 폐미세혈관 내피세포의 손상을
악화시키거나 완화시킬 수 있는지를 관찰하였다.
방 법 :
산화제에 의한 세포손상은 백서 폐미세혈관 내피세포에 과산화수소를 생성하는 glucose
oxidise(GO)를 투여하여 야기 시키고 이를 51Cr 방출 측정으로 평가하였다.
산화제에 의한 폐혈관 내피세포의 손상에 외인성 NO가 미치는 영향은 NO 공여물인 SNAP
혹은 SNP를 산화제와 동시에 투여하여 평가하였다. 산화제에 의한 폐혈관 내피세포의 손상
에 내인성 NO 억제가 미치는 영향은 NOS 길항제인 L-NMMA을 추가로 투여하여 평가하
였다. INF-γ, TNF-α, LPS 등으로 내인성 NO 생성을 자극한 후 L-NMMA의 효과도 관
찰하였으며, NO 공여물이나 내피세포로부터의 NO생성은 nitrite 측정으로 평가하였다.
결 과 :
백서 폐 미세혈관 내피세포에서 51Cr 방출이 GO 5mU/㎖에서 8.7±0.5%,
10 mU/㎖에서 14.4±2.9%, 15 mU/㎖에서 32.3±2.9%, 20 mU/㎖에서 55.5±0.3%, 30 mU/
㎖에서 67.8±0.9%로 GO 15 mU/㎖ 이상에서 대조군의 9.6±0.7%에 비하여 유의하게 증가
하였으며(P<0.05 ; n=6), 이에 0.5 mM L-NMMA를 추가하여도 영향이 없었다.
INF-γ 500 U/㎖, TNF-α 150 U/㎖, LPS 1 ㎍/㎖을 배양액에 첨가하여 24시간 경과 시
배양액 중 nitrite 농도가 3.9±0.3 μM로 증가하였으며, 이에 L-NMMA 0.5 mM을 첨가하
면 0.2±0.1 μM로 유의하게 억제되었다(p<0.05 ; n=6). INF-γ, TNF-α, LPS 자극 후 GO
에 의한 51Cr 방출에 L-NMMA는 영향을 주지 않았다.
GO 20 mU/㎖에 의한 51Cr 방출이 SNAP 100 μM의 추가로 대조군 수준
으로 현저히 억제되었으나, SNP, potassium ferrocyanide, potassium ferricyanide 등의 추가
는 영향이 없었다.
Hanks' balanced salt solution(HBSS) 중의 SNAP 100 μM로부터 4시간 동안 nitrite가
23.0±1.0 μM농도로 축적되었으나, SNP는 1 mM에서도 nitrite가 검출되지 않았다.
SNAP은 HBSS 중의 GO가 과산화수소를 시간경과에 따라 생성하는데 영향이 없었다.
결 론 :
결론적으로 폐미세혈관 내피세포에서 GO에 의하여 생성되는 과산화수소로 산화제 손상을
야기하였으며, NO 공여물인 SNAP으로부터 제공된 외인성 NO가 산화제 손상을 방지하고
이 보호효과는 NO 방출 능력에 의할 가능성이 시사되었다. 따라서 생체내 환경에 따라 외
인성 NO가 내피세포에 대한 산화제 손상에 보호 효과가 있을 수 있다고 추정된다.
#초록#
Background : Nitric oxide(NO) is an endogenously produced free radical that plays an
important role in regulating vascular tone, inhibition of platelet aggregation and white
blood cell adhesion to endothelial cells, and host defense against infection. The highly
reactive nature of NO with oxygen radicals suggests that it may either promote or
reduce oxidant-induced cell injury in several biological pathways. Oxidant injury and
interactions between pulmonary vascular endothelium and leukocytes are important in
the pathogenesis of acute lung injury, including acute respiratory distress
syndrome(ARDS). In ARDS, therapeutic administration of NO is a clinical condition
providing exogenous NO in oxidant-induced endothelial injury. The role of exogenous
NO from NO donor or the suppression of endogenous NO production was evaluated in
oxidant-induced endothelial injury.
Method : The oxidant injury in cultured rat lung microvascular endothelial
cells(RLMVC) was induced by hydrogen peroxide generated from glucose oxidate(GO).
Cell injury was evaluated by 51chromium(51Cr) release
technique. NO donor, such as S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP) or sodium
nitroprusside(SNP), was added to the endothelial cells as a source of exogenous NO.
Endogenous production of NO was suppressed with
N-monomethyl-L-arginine(L-NMMA) which is an NO synthase inhibiter. L-NMMA was
also used in increased endogenous NO production induced by combined stimulation with
interferon-γ(INF-γ), tumor necrosis factor-α(TNF-α), and lipopolysaccharide(LPS).
NO generation from NO donor or from the endothelial cells was evaluated by measuring
nitrite concentration.
Result : 51Cr release was 8.7±0.5% in GO 5 mU/㎖, 14.4±2.9% in GO
10 mU/㎖, 32.3±2.9% in GO 15 mU/㎖, 55.5±0.3% in GO 20 mU/㎖ and 67.8±0.9% in
GO 30 mU/㎖ ; it was significantly increased in GO 15 mU/㎖ or higher concentrations
when compared with 9.6±0.7% in control(p<0.05 ; n= 6). L-NMMA(0.5mM) did not
affect the 51Cr release by GO.
Nitrite concentration was increased to 3.9±0.3 μM in culture media of RLMVC
treated with INF-γ(500 U/㎖), TNF-α(150 U/㎖) and LPS(1 ㎍/㎖) for 24 hours ; it
was significantly suppressed by the addition of L-NMMA. The presence of L-NMMA
did not affect 51Cr release induced by GO in RLMVC pretreated with
INF-γ, TNF-α and LPS.
The increase of 51Cr release with GO(20 mU/㎖) was prevented
completely by adding 100 μM SNAP. But the add of SNP, potassium ferrocyanate or
potassium ferricyanate did not protect the oxidant injury.
Nitrite accumulation was 23±1.0 μM from 100 μM SNAP at 4 hours in phenol red
free Hanks' balanced salt solution. But nitrite was not detectable from SNP upto 1 mM.
The presence of SNAP did not affect the time dependent generation of hydrogen
peroxide by GO in phenol red free Hanks' balanced salt solution.
Conclusion : Hydrogen peroxide generated by GO causes oxidant injury in RLMVC.
Exogenous NO from NO donor prevents oxidant injury, and the protective effect may be
related to the ability to release NO. These results suggest that the exogenous NO may
be protective on oxidant injury 13 the endothelium.

키워드

Nitric oxide; Oxidants Endothelium;

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